涞源：Francezon, N., and Stevanovic, T. (2017)
【摘要】
首次采用蒸汽蒸馏（SD）和水蒸馏（WD）两种加氢蒸馏方法获得了黑云杉（Picea mariana）树皮的精油和纯露。使用气相色谱法和质谱法分析时，两者都给出了相似的产率和组成。
精油成分为松节油类，主要为α-蒎烯（40.6%SD；40.5%WD）和β-蒎ne（33.9%SD；25.9%WD），其次为碳氢化合物单萜β-水芹烯（4.8%SD；3.6%WD）、3-芳烃（4.1%SD；3.1%WD）和柠檬烯（4.0%SD；3.7%WD）。
纯露Hydrosol的成分富含含氧化合物，包括α-松油醇（29.3%标准差；33.5%WD）、反式皮诺卡韦醇（5.2%标准差；3.7%WD）、松油醇-4-醇（5.0%标准差）、5.8%WD、马鞭烯酮（4.9%标准差，5.4%WD），冰片（4.9%标差，3.9%WD）和皮诺香芹酮（4.6%标准差和4.3%WD）。这些黑云杉皮精油在成分上与黑云杉针叶精油不同，针叶精油主要富含乙酸龙脑酯。
【引言】
针叶树多以其宜人的树脂和萜烯气味而闻名，这是大森林的特征。市场上比较常见的有几种通过针叶蒸馏获得的软木精油，即松树、冷杉、雪松或云杉的精油。另一种著名的针叶树精油是从松脂中提取的松节油。
含有树脂通道的针叶树的精油和油树脂可以在所有植物部位找到。然而，从同一植物的不同部位获得的精油的成分可能会有所不同，这包括微小的差异（产量）到重要的差异（成分）。例如，肉桂树产生了两种不同的精油，一种含有87%丁香酚作为主要成分的叶子部位提取的精油，另一种是含97%肉桂醛的树皮（Singh等人，2007）。如前所述，针叶树精油的成分也可能因所分析的部分而异（Kubeczka和Schultze，1987年）。
黑云杉（Picea mariana（Miller）B.S.P.）是加拿大北方森林中最重要的工业物种之一。在伐木和木材转化过程中，它的加工会产生大量的生物质残留物，在烘干的基础上，每棵树由13%的树叶、6%的树枝和8%的树皮组成（Desrochers 2011）。目前，树叶多被用来生产黑云杉的精油，这种精油被广泛用于芳香疗法。Shaw首次描述了其组成，以乙酸龙脑酯为主要化合物（37%），其次是α-蒎烯（16%）、樟脑（10%）、β-蒎ne（6.5%）和柠檬烯（6.5%）（Shaw 1950；Guenther 1952）。
Garneau等人研究了在加氢蒸馏过程中从黑云杉针叶中获得的水溶胶（也称为蒸馏水）（2012）。其成分富含含氧化物，单萜，主要由α-萜品醇（14.8%）、龙脑（13.5%）、乙酸龙脑酯（7.8%）和萜品烯-4-醇（6.5%）组成。至于树皮，已经进行了研究，以生产富含多酚的提取物为主（Diouf等人，2009；Garcia Perez等人，2012），但尚未对其加氢蒸馏生产精油进行研究。此外，迄今为止，很少有关于针叶树茎皮精油化学成分的报道，也没有发现关于云杉属的报道。
本研究旨在通过气相色谱法和质谱法表征通过蒸汽蒸馏和水蒸馏两种不同方法提取的针叶树皮残留茎皮精油和纯露的化学成分。
【实验说明】
材料
用于气相色谱分析的分析标准分子，α-蒎烯、β-蒎ne、柠檬烯、樟脑、4-乙基苯酚、龙脑、樟脑、沙宾烯、α-水芹烯、3-芳烃、对-cymene、α-萜品醇、马鞭烯酮、顺式月桂醇、乙酸龙脑酯、β-石竹烯和香芹酮购自Sigma Aldrich（美国圣路易斯）。正己烷和无水硫酸钠购自Fisher Scientific（Tustin，Canada）。新鲜的黑云杉树皮（P.mariana）由位于加拿大魁北克省Sacreé-Coeur的锯木厂供应。这些树皮是2015年6月从锯木厂对原产于Labrieville地区的原木进行剥皮时收集的，该地区距离加拿大魁北克省Forestville 140公里。对树皮进行研磨和筛分，以选择2毫米至1毫米的颗粒，然后在-20°C的黑暗中储存。
方法
挥发性成分的分离
黑云杉精油是通过两种不同的方法获得的：蒸汽蒸馏（SD）和水蒸馏（WD）。
用于加氢蒸馏的装置由一个20-L铝蒸馏器（All American，Hillsville，USA）组成，该蒸馏器在工厂的车间进行了改造，以满足加热系统、蒸汽入口连接（2L/h蒸汽流量）和冷凝器的实验需求（Schmidt 2015）。为了通过蒸汽蒸馏提取精油，在植物材料的底部输入蒸汽，将挥发性分子携带到冷凝器中，以产生精油和纯露。除了蒸馏器外，使用相同的条件进行水蒸馏，蒸馏器填充15L热水，使植物材料在该过程中完全浸入在水中。沸水产生一股蒸汽，将挥发性化合物输送到冷凝器（Boutekedjiret等人，2003年）。每200克新鲜树皮（相当于73克干物质）综合处理6小时，以获得34.3毫克蒸汽蒸馏精油和38.7毫克水蒸馏精油。然后，将WD和SD过程中产生的350 mL的纯露用3 mL×200 mL正己烷进行萃取。提取分三次进行，将获得的油和纯露提取物在无水硫酸钠上干燥，并在分析前，储存在4°C下。
气相色谱分析 GC
在配备火焰离子化检测器（FID）的瓦里安CP-3800气相色谱法（瓦里安股份有限公司，美国胡桃溪）上进行气相色谱（GC）分析。根据以下温度程序，在Agilent J&W VF-5ms（Agilent Technologies，Santa Clara，USA）（30 m×0.25 mm×0.25µm）和5%苯基甲基柱上实现分离：50°C至200°C，3°C/min。注射器和检测器的温度分别为250°C和285°C，载气He的流速为1 mL/min。以1:10的比例注入1µL样品。从FID色谱图中计算分离的化合物的相对百分比。
气相色谱-质谱分析
气相色谱-质谱（GC-MS）分析是在瓦里安土星2200 GC/MS/MS（瓦里安股份有限公司，美国核桃溪）上进行。质谱（MS）通过70eV的电子冲击在电子电离模式下操作，并且MS信号采集设置在30m/z和600m/z之间。色谱柱和温度条件与GC-FID分析中使用的色谱柱和条件相同。通过将质谱与NIST 02、Adams和Essentia数据库中可用的质谱进行比较来进行峰值识别，以及通过将其保留指数值与文献报告结果进行比较，尽可能经常使用VF-5ms柱（Hennebelle et al. 2006; De Pinho et al. 2009; Leffingwell and Alford 2011; Robinson et al. 2011; Rossi et al. 2011; Feijó et al. 2014; Guerrini et al. 2014; Nurzyńska-Wierdak 2014; Chaftar et al. 2016）。使用饱和烷烃（C7-C30）的混合物（Supelco，Bellefonte，USA）作为参考，根据Kovats方程计算保留指数值。在可能的情况下，使用提交人实验室可用的分析标准来确认鉴定。
【结果和讨论】
精油成分
通过蒸汽蒸馏或水蒸馏生产的黑云杉树皮精油的产量被确定为0.05%。相比之下，这一产量比P.mariana针叶水蒸馏的产量（0.4%至0.6%）低十倍（Guenther 1952）。Rudloff（1975）后来报道，从黑云杉针叶中提取的产量更高，为1.3%，而从树枝中提取的产率为0.3%。
通过蒸汽和水蒸馏从黑云杉树皮中生产的精油的化学成分非常相似（表1）。它们都主要由碳氢化合物单萜组成；还测定了一些倍半萜，因为水蒸馏提取倍半萜的效率略高（2.9%，而蒸汽蒸馏占总油的0.8%）。据报道，在先前研究的针叶树精油中，倍半萜的比例很少超过10%，而且它们在云杉精油中似乎普遍非常罕见（Kubeczka和Schultze，1987年）。含氧单萜类化合物构成了从黑云杉树皮中获得的油的组成部分，在SD精油中的的部分低于从WD获得的油。事实上，水蒸馏精油含有18种含氧化合物，占精油的6.3%，而蒸汽蒸馏精油含有6种含氧单萜，占1.1%。这可以部分解释为水蒸馏过程中在水存在的情况下发生的化学转化，这是由导致单萜烯醇形成的烃单萜烯的潜在水解反应引起的（Boutekedjiret等人，2003）。
图1 黑云杉树皮精油的气相色谱分析
主峰的鉴定：1:α-蒎烯；2：β-蒎烯；3:3-芳烃；4：柠檬烯；和5:β-水飞烯。
黑云杉皮精油成分主要是双环单萜α-蒎烯，几乎占总成分的一半，蒸汽蒸馏油和水蒸馏油分别占40.6%和40.5%（图1）。其异构体β-蒎烯是第二大化合物，SD和WD的高比率分别为33.9%和25.9%。可见，松节油占黑云杉树皮精油的三分之二以上，其表现出与松节油相同的特征（Stevanovic和Perrin，2009年），主要来自松属。为了进行比较，黑云杉松节油的化学成分显示出相同的模式，主要是α-蒎烯（54.3%）和β-蒎烷（25.3%）（Borg-Karlson等人，1993），这证实了云杉属树脂油挥发性部分具有与松树挥发油相当的成分。据报道，用己烷提取的P.mariana木材中也含有α-蒎烯和β-蒎ne作为主要的单萜，分别占己烷提取物总量的19%（心材）和15%（边材）以及较重的二萜类化合物（Pichette等人，1998）。正如关于P.abies松节油的报道（Borg-Karlson等人，1993），在本研究中研究的黑云杉树皮的蒸汽蒸馏油和水蒸馏油中，发现了其他三种主要分子3-芳烃、柠檬烯和β-水芹烯的比例相等。
在研究中可见，黑云杉树皮精油主要由碳氢化合物单萜组成，而黑云杉针叶精油由37%至46.5%的含氧单萜乙酸冰片酯组成（Guenther 1952；Rudloff 1975）。而乙酸硼酸酯仅在黑云杉树皮精油中以微量进行测定。这一结果与先前的文献（Rudloff 1975）一致，其中乙酸龙脑酯仅占树枝（富含树皮和幼木）油的1.3%，而它是P.mariana针叶油的主要成分。Rudloff还报道了树枝中大量的α-和β-蒎烯（分别为18.4%和9.8%），但存在的最高化合物是3-芳烃，它占树枝油总成分的一半。
这些差异可能可以用植物组织的成熟度来解释：在这项研究中，将幼龄树皮和树枝中的木材与成熟茎树皮进行了比较。因此，碳氢化合物单萜是针叶树树脂中最常见的成分，尤其是松烯、沙宾烯、3-芳烃和柠檬烯（Kubeczka和Schultze，1987年），而含氧单萜类化合物在花或叶的精油中更为丰富（Stevanovic和Perrin，2009年）。这一点在色谱图中很容易看出（图1）：精油色谱图显示，碳氢化合物单萜烯区域的化合物明显丰富，而含氧单萜烯区几乎为空。
纯露成分
在两个不同萃取过程中产生的纯露在组成上相当相似，并且显示出可比较的萜类化合物浓度（SD为60mg/L，WD为56mg/L）（表2）。
它们完全由含氧的单萜类化合物组成，α-松油醇是主要成分，占已鉴定出的反式皮诺卡韦醇、松油醇-4-醇、龙脑醇、马鞭烯酮和皮诺香芹酮中纯露总成分的三分之一（图2）。两种纯露之间唯一明显的区别是在水蒸馏纯露中不存在单萜和倍半萜的碳氢化合物，SD纯露含有α-和β-蒎烯（分别为1.1%和1.5%）、柠檬烯、β-水芹烯和一些倍半萜。然而，与含氧单萜类化合物相比，碳氢化合物单萜类在纯露中的溶解度很低，因此它们在水中的存在量仍然很低（Rao等人，2002）；α-萜品醇在水中的溶解度达到710 mg/L，而α-和β-蒎烯的溶解度分别为2.49 mg/L和4.89 mg/L（Garneau等人，2012）。
图2。黑云杉树皮纯露的气相色谱图；主峰的鉴定：6:反式皮诺卡韦醇；7：冰片；8：萜品烯-4-醇；9：α-萜品醇；和10:马鞭草酮
有趣的是，在黑云杉针叶纯露中，α-松油醇与冰片、乙酸冰片酯和松油醇-4-醇一起被确定为主要成分（Garneau等人，2012）。据报道，黑云杉木材的己烷提取物中也存在α-萜品醇（Pichette等人，1998）。
纯露可以用于香水行业、化妆品或食品配料，它们也可以用另一种亲脂性溶剂做进一步提取，以获得“二级”油，而不是在蒸馏过程中自然蒸馏的一级油【这也是为什么专业芳疗一定只选择自然蒸馏的部分】。
表1 蒸汽蒸馏和水蒸馏 黑云杉精油的成分
精油；b： 水蒸馏精油；c： MS（质谱）、RI（保留指数）和Std（标准分子）。
表2 蒸汽蒸馏和水蒸馏 纯露 的组成
纯露；b： 水蒸馏纯露；c： MS（质谱）、RI（保留指数）和Std（标准分子）。
这项研究中获得的结果表明，从黑云杉树皮蒸汽或水蒸馏中提取的精油和纯露这两种产品均具有增值的潜力。精油主要由萜烯烃组成，萜烯烃的组成类似于松节油的组成，松节油对应于黑云杉油树脂的挥发性部分。这些产品中的每一种都可以找到合适的特定应用。
结论
这是第一项报道通过蒸汽或水蒸馏黑云杉树皮获得的挥发油和纯露的表征的研究。
黑云杉树皮精油由单萜烃组成，主要为α-和β-蒎烯。
经测定，主要成分为α-萜品醇的含氧挥发性成分集中在水溶性部分。
就挥发油和纯露的产量及其组成而言，黑云杉树皮的蒸汽蒸馏和水蒸馏获得的结果是可比较的。从黑云杉树皮中生产精油，尽管产量很低，但可以在放大过程中使用更多材料进行优化，以达到更可接受的速率。
这项研究代表了一种新的方法，通过生产黑云杉树皮的精油，将树皮作为木材转化废物进行估价，该精油可以推断为其他针叶树物种的树皮残留物。
——————参考
REFERENCES CITED
Borg-Karlson, A., Lindström, M., Norin, T., Persson, M., and Valterová, I. (1993). “Enantiomeric composition of monoterpene hydrocarbons in different tissues of Norway spruce, Picea abies (L) Karst. A multi-dimensional gas chromatography study,” Acta Chemica Scandinavia 47, 138-144.
Boutekedjiret, C., Bentahar, F., Belabbes, R., and Bessiere, J. M. (2003). “Extraction of rosemary essential oil by steam distillation and hydrodistillation,” Flavour and Fragrance Journal 18(6), 481-484. DOI: 10.1002/ffj.1226
Chaftar, N., Girardot, M., Labanowski, J., Ghrairi, T., Hani, K., Frere, J., and Imbert, C. (2016). “Comparative evaluation of the antimicrobial activity of 19 essential oils,” Advances in Experimental Medicine and Biology 901, 1-15. DOI: 10.1007/5584_2015_5011
De Pinho, P. G., Goncalves, R. F., Valentao, P., Pereira, D. M., Seabra, R. M., Andrade, P. B., and Sottomayor, M. (2009). “Volatile composition of Catharanthus roseus (L.) G. Don using solid-phase microextraction and gas chromatography/mass spectrometry,” Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 49(3), 674-685. DOI: 10.1016/j.jpba.2008.12.032
Desrochers, L. (2011). “Récolte et ségrégation de la biomasse ligneuse en forêt (Harvest and segregation of lineous biomass in forest),” QWEB- Les extractibles forestiers (Forest extractibles), FPInnovations (https://fpinnovations.ca/).
Diouf, P. N., Stevanovic, T., and Cloutier, A. (2009). “Study on chemical composition, antioxidant, and anti-inflammatory activities of hot water extract from Picea mariana bark and its proanthocyanidin-rich fractions,” Food Chemistry 113(4), 897-902. DOI: 10.1016/j.foodchem.2008.08.016
Feijó, E. V. R. d. S., De Oliveira, R. A., and Costa, L. C. d. B. (2014). “Light affects Varronia curassavica essential oil yield by increasing trichomes frequency,” Revista Brasileira de Farmacognosia 24(5), 516-523. DOI: 10.1016/j.bjp.2014.10.005
Fleisher, A. (1991). “Water-soluble fractions of the essential oils,” Perfumer and Flavorist 16(3), 37-41.
Garcia-Perez, M. E., Royer, M., Herbette, G., Desjardins, Y., Pouliot, R., and Stevanovic, T. (2012). “Picea mariana bark: A new source of trans-resveratrol and other bioactive polyphenols,” Food Chemistry 135(3), 1173-1182. DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.05.050
Garneau, F. -X., Collin, G., Gagnon, H., and Pichette, A. (2012). “Chemical composition of the hydrosol and the essential oil of three different species of the Pinaceae family: Picea glauca (Moench) Voss., Picea mariana (Mill.) B.S.P., and Abies balsamea (L.) Mill,” Journal of Essential Oil Bearing Plants 15(2), 227-236. DOI: 10.1080/0972060x.2012.10644040
Guenther, E. (1952). The Essential Oils, (Vol. VI), D. Van Nostrand Company, Inc., New York.
Guerrini, A., Rossi, D., Grandini, A., Scalvenzi, L., Rivera, P. F. N., Andreotti, E., and Maietti, S. (2014). “Biological and chemo-diverse characterization of Amazonian (Ecuador) citrus petitgrains,” Journal of Applied Botany and Food Quality 87. DOI: 10.5073/jabfq.2014.087.017
Hennebelle, T., Sahpaz, S., Dermont, C., Joseph, H., and Bailleul, F. (2006). “The essential oil of Lippia alba: Analysis of samples from French overseas departments and review of previous works,” Chemistry & Biodiversity 3(10), 1116-1125. DOI: 10.1002/cbdv.200690113
Kubeczka, K. H., and Schultze, W. (1987). “Biology and chemistry of conifer oils,” Flavour and Fragrance Journal 2(4), 137-148.
Leffingwell, J. C., and Alford, E. (2011). “Volatile constituents of the giant puffball mushroom (Calvatia gigantea),” Leffingwell Reports 4, 1-17.
Nurzyńska-Wierdak, R. (2014). “Biological active compounds from roots of Valeriana officinalis (L.) cultivated in south-eastern region of Poland,” Farmacia 62(4), 683-692.
Pichette, A., Garneau, F. -X., Jean, F. -I., Riedl, B., and Girard, M. (1998). “Chemical differences between the wood extracts of jack pine (Pinus banksiana), black spruce (Picea mariana), and balsam fir (Abies balsamea) from eastern Canada,” Journal of Wood Chemistry and Technology 18(4), 427-438. DOI: 10.1080/02773819809349590
Rao, B. R., Kaul, P., Syamasundar, K., and Ramesh, S. (2002). “Water soluble fractions of rose-scented geranium (Pelargonium species) essential oil,” Bioresource Technology 84(3), 243-246. DOI: 10.1016/S0960-8524(02)00057-3
Robinson, A. L., Boss, P. K., Heymann, H., Solomon, P. S., and Trengove, R. D. (2011). “Development of a sensitive non-targeted method for characterizing the wine volatile profile using headspace solid-phase microextraction comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry,” Journal of Chromatography A 1218(3), 504-517. DOI: 10.1016/j.chroma.2010.11.008
Rossi, D., Guerrini, A., Maietti, S., Bruni, R., Paganetto, G., Poli, F., and Sacchetti, G. (2011). “Chemical fingerprinting and bioactivity of Amazonian Ecuador Croton lechleri Müll. Arg. (Euphorbiaceae) stem bark essential oil: A new functional food ingredient,” Food Chemistry 126(3), 837-848. DOI: 10.1016/j.foodchem.2010.11.042
Rudloff, E. (1975). “Seasonal variation in the terpenes of the foliage of black spruce,” Phytochemistry 14(8), 1695-1699.
Schmidt, E. (2015). “Production of essential oils,” in: Handbook of Essential Oils: Science, Technology, and Applications, K. H. C. Baser, and G. Buchbauer (ed.), CRC Press, Boca Raton, pp. 99-117.
Shaw, A. C. (1950). “The essential oil of Picea mariana (Mill.) B.S.P.,” Canadian Journal of Research 28(B), 268-276.
Singh, G., Maurya, S., De Lampasona, M. P., and Catalan, C. A. (2007). “A comparison of chemical, antioxidant, and antimicrobial studies of cinnamon leaf and bark volatile oils, oleoresins, and their constituents,” Food and Chemical Toxicology 45(9), 1650-1661. DOI: 10.1016/j.fct.2007.02.031
Stevanovic, T., and Perrin, D. (2009). “Les extractibles du bois (Wood extractibles),” in: Chimie du Bois (Wood Chemistry), Presses Polytechniques et Universitaires Romandes (ed), Lausanne, Suisse, pp. 209-212.
Article submitted: December 7, 2016; Peer review completed: February 6, 2017; Revised version received and accepted: February 8, 2017; Published: February 21, 2017.
【说明】本文是 2017年 Francezon, N., and Stevanovic, T. (2017)，联合发表的关于黑云杉树皮提炼精油和纯露的研究，也是国际上第一篇从此角度做研究的试验性文献研究，在2023年我们组织黑云杉纯露团购的时候，特意将此文做了相应的翻译，与诸位喜欢芳疗，热爱自然疗法的同仁分享。
翻译匆忙，错误之处难免，敬请指正谅解！ （译者：辛禾 国际芳疗师，平衡小柅/柅愈精油品牌创始人。 ）
